物理化学学报  2017, Vol. 33 Issue (10): 2052-2057   (1312 KB)    
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  • Received: March 29, 2017
  • Revised: May 2, 2017
  • Published on Web: May 10, 2017
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    DNA的滚环扩增合成研究
    刘淑贞, 张志庆*, 王芳, 周亭, 王秀凤, 张国栋, 刘婷婷, 张洪芝    
    中国石油大学(华东)理学院, 山东 青岛 266580
    摘要:滚环扩增(RCA)反应作为一种简单高效的等温酶促反应,现已发展为核酸扩增领域的新技术,其产物在组装体搭建和多功能材料的制备方面有着广泛的应用。本文采用琼脂糖凝胶、紫外和透射电镜(TEM)等手段,探究了时间、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTPs)、酶以及引物的浓度等因素对脱氧核糖核酸(DNA)滚环扩增产物的影响。结果表明:在反应开始的前30 min,RCA产物的长度受时间的影响比较明显;随着dNTPs浓度的提高,RCA产物的链长增长,浓度也不断提高;酶和引物的浓度对滚环扩增产物的长度没有明显影响,但对RCA产物浓度的影响较大,过量的酶致使RCA产物的含量显著下降。
    关键词滚环扩增技术    核酸    dNTPs    聚合酶    引物    

    1 引言

    近年来,分子生物学和生物化学发展迅速,新的核酸扩增技术不断涌现,滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)反应作为一种简单高效的等温酶促反应发展迅速,现已成为核酸扩增技术的新宠1。在RCA反应中,聚合酶连续不断地将核苷酸添加到环状模板的引物上,形成一条含有几十、几百甚至上千个相互串联重复单元的单链DNA。不同于聚合酶链式(Polymerase Chain Reaction,PCR)反应需要昂贵精密的设备和热稳定性的聚合酶2,RCA反应可以在恒温条件下的溶液中,固相支持物上,甚至一个复杂的生物环境中进行反应3

    滚环扩增反应作为一种强大的核酸扩增工具,其产物在许多方面都有着广泛的应用。如Mao等4利用长度不同的RCA产物与金纳米颗粒进行组装,得到不同长度的金纳米线;Willner等5将RCA产物作为酶有序装配杂交复合材料的骨架,表现出强大的结构衍生性功能;在DNA折纸术6中,利用长度合适的RCA产物作为骨架链,添加互补短链作为脚手架链,制备具有不同形貌的组装体7, 8。基于RCA产物搭建的组装体含有众多的重复单元,这种独特的组装体可携带大量的用于检测和治疗的物质,例如荧光素、生物素、抗体、纳米粒等;同时也可以通过环状模板的设计,将RCA产物设计成含有适配子、DNA酶、垫片、内切位点等功能化序列,制备多功能材料用于生物识别、药物递送、生物传感等9-20。现在,滚环扩增技术又在DNA纳米粒子(DeNAno):新型多价亲和试剂21方面崭露头角,这更加拓宽了滚环扩增技术的应用。

    控制RCA产物的长度和浓度对于后续的组装和应用至关重要,但是鲜见较系统的研究各种合成条件对RCA产物影响的报道。因此,本文系统考察了时间、dNTPs的浓度、酶的浓度以及引物的浓度等因素对RCA产物长度和浓度的影响,并利用琼脂糖凝胶电泳、紫外和TEM等手段对RCA产物进行表征。

    2 实验部分
    2.1 试剂

    实验所用核苷酸序列(序列见表 1)及dNTPs(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)均购自大连Takara生物技术公司(序列见表 1),保存在-20 ℃;phi29 DNA聚合酶,购买于Thermo Fisher Scientific,保存于-20 ℃;琼脂糖、TAE缓冲溶液、6 ×上样缓冲液和DNA标准条带(DNA Ladder,0.2-10 kb, 21 bands)均购买于碧云天生物技术。本文中用水皆为高纯水。

    表 1 核苷酸序列 Table 1 Sequences of oligonucleotides used in RCA reactions.

    2.2 合成及表征方法
    2.2.1 滚环扩增合成

    取一定量的环状DNA1模板于离心管中,加入一定量的引物DNA2和dNTPs,用混匀仪混匀15 s;再加入一定量的phi29 DNA聚合酶及缓冲溶液和一定量的水,混匀,在30 ℃下反应一段时间,65 ℃下终止反应。

    2.2.2 琼脂糖凝胶电泳表征

    配置1 × TAE缓冲溶液,至于水平电泳槽中,用于跑胶。取2 μL DNA ladder加入2 μL 6 ×上样缓冲液和6 μL H2O混匀,再各取8 μL RCA产物和2 μL 6 ×上样缓冲液混匀,在0.6%琼脂糖凝胶上进行上样,300 V恒压下进行电泳,在凝胶成像仪下进行观察和拍摄。本文琼脂糖凝胶电泳所用ladder皆与图 1a中一致。

    图 1 时间对RCA产物的影响 Fig. 1 Effect of reaction time on RCA product. (a, b) the agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different time. bp indicates the number of bases.

    2.2.3 吸收光谱表征

    首先对微量紫外分光光度计(Nanodrop,杭州奥胜Nano-100) 进行空白校准,然后取2 μL RCA产物置于Nanodrop上进行测试,保存数据和图片,进行数据分析。

    2.2.4 透射电镜表征

    取10 μL RCA产物置于铜网上沉积一段时间,1%醋酸双氧铀染色,使用日本电子JEM-2100高分辨透射电镜进行表征和分析。

    3 结果与讨论
    3.1 时间的影响

    首先考察不同反应时间对RCA产物的影响,从图 1a1b上可明显的发现,反应开始的前半个小时,RCA产物的长度受时间的影响比较显著,之后随时间的延长RCA产物的长度不再有明显改变。早期的RCA研究者,Eric T Kool等发现时间对RCA产物的长度有着一定的影响22,而我们的实验结果与之非常类似。胶谱图 1a上RCA产物的亮度随着反应时间的延长而逐渐变亮,说明最开始反应阶段不仅产物的长度比较短,而且浓度也比较低。反应过程中,随着时间的延长产物的长度不断增长,浓度也逐渐增加,直至反应达到平衡22。在反应的过程中,长时间反应的体系中有白色絮状沉淀物析出,因为在反应初期,RCA产物首先形成一种无定形结构,随着反应的进行,RCA产物在基质表面形成一些类晶结构,RCA产物继续在这些类晶结构的表面上进行组装形成花瓣结构,逐渐形成花状球形结构。RCA产物可以通过链内和链间的杂交(DNA纳米花的组装不依赖于传统的Watson-Crick碱基配对)进行交联形成紧密的结构,在局部累积形成DNA纳米花23。用TEM对30 min的反应产物进行扫描,观察到有很多粘连的球状物,尺寸在300 nm左右(如图 2a2b)。

    图 2 RCA产物的TEM图 Fig. 2 TEM images of the RCA product. (a, b) TEM images of the RCA product at 30 min.

    3.2 dNTPs的影响

    在RCA体系中加入不同浓度的dNTPs,发现dNTPs的浓度对RCA产物的长度有着非常显著的影响。从胶谱图 3a上可以明显观察到,随着dNTPs浓度的增加,RCA产物的长度不断增长;当dNTPs的浓度增加到一定值时(环状DNA1模板:dNTPs摩尔浓度比为1 : 250),RCA产物的长度则不再明显增长,再增加dNTPs的浓度对RCA产物长度的影响已经不大,这可能是由phi29 DNA聚合酶的聚合扩增能力决定的24

    图 3 dNTPs摩尔浓度对RCA产物的影响 Fig. 3 Effect of dNTPs molar concentration on RCA product. (a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of dNTPs; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of dNTPs; (c) The concentration of RCA product at different concentrations of dNTPs; (d) Comparison of analytical data for OD260/280 and OD260/230 at different concentrations of dNTPs. OD ratio represents the absorbance ratio.

    图 3c所示,RCA产物的浓度随dNTPs浓度的提高而不断提高,而且随着dNTPs浓度的提高,体系紫外吸收峰的位置逐渐左移靠近260 nm(图 3b)。OD260与OD280吸光度的比值越接近1.8(OD为光密度),代表DNA的纯度越高,超过或低于1.8都代表有别的污染物;而OD260与OD230吸光度的比值一般在1.8-2.2之间,表明DNA纯度较好25-27图 3d所示,Nanodrop分析给出的OD260/280的比值逐渐接近1.8,OD 260/230的吸光度比值逐渐接近2.0,说明随着dNTPs浓度的增加,体系中RCA产物的含量逐渐提高,至环状DNA1模板与dNTPs的摩尔浓度比为1 : 500时,体系中RCA产物的含量达到最高。在dNTPs浓度较低时,RCA反应启动的数量受限,随着dNTPs浓度的提高,RCA反应启动的数量增加,体系中RCA产物的含量不断增加,直至体系中环、引物和酶被充分利用。

    3.3 酶的影响

    聚合酶在整个RCA反应中有着非常重要的作用,只有在聚合酶的作用下,才能启动整个反应。而在RCA反应体系中,使用聚合酶的种类不同,对反应产物的影响也不尽相同28。随着滚环扩增技术的发展,新型的聚合酶不断地被发现使用。本文选用的phi29 DNA聚合酶,具有强大的链取代能力和高效的持续扩增能力,可以克服拓扑约束并有效地形成单链DNA 29

    实验中加入不同浓度的phi29 DNA聚合酶进行反应,考察酶的活性浓度对RCA产物长度和浓度的影响。结果发现phi29 DNA聚合酶对RCA产物的长度并没明显的影响(图 4a),但对RCA产物的浓度影响显著(图 4b),随着酶浓度的提高,RCA产物的浓度先增大后减小。同时,Nanodrop分析给出的OD260/280和OD260/230吸光度比值显示(图 4c),随着酶浓度的提高,体系中OD260/280的比值先接近1.8随后降低,OD260/230的比值先接近2.0随后降低,说明随着酶浓度的增加,过量的酶影响了RCA产物的相对含量。酶浓度的增加(体系中蛋白含量逐渐增加),在环、引物和dNTPs的起始量相同的条件下,酶的加入量越多,在反应最终结束时,RCA产物的相对含量越低。而这对后续RCA产物的提纯不利,因此在RCA反应顺利进行的前提下可以降低酶的浓度,这样既可保证体系的产率,又降低了经济成本。

    图 4 phi29 DNA聚合酶对RCA产物的影响 Fig. 4 Effect of phi29 DNA polymerase on RCA product. (a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase; (c) Comparison of analytical data for OD260/280 and 260/230 at different concentrations of phi29 DNA polymerase. U indicates enzyme activity concentration.

    3.4 引物的影响

    为了考察引物对RCA产物的影响,设计相同反应时间下引物浓度不同的实验。胶谱图 5a所示,RCA产物的长度不随引物浓度的改变而改变,产物的浓度随引物浓度的提高而增加。由于引物的浓度决定了酶的附着位点,也决定了RCA反应引发的数量,继而决定了RCA产物的浓度。图 5b所示,当环状DNA1模板与引物摩尔浓度比为1 : 1时,RCA产物的浓度达到最高,再增加引物浓度RCA产物的浓度反而有所下降。Nanodrop分析给出的OD260/280和OD260/230吸光度的比值随引物的增加而逐渐增大(图 5c),至环状DNA1模板与引物摩尔浓度比为1 : 1时,OD260/280的比值达到1.8左右,再增加引物反而影响了RCA产物的含量。因为随着引物的增加,酶的附着位点增多,引发的RCA反应增多,体系中RCA产物的相对含量增加;同时,附着位点的增加导致dNTPs的消耗量增加,游离的dNTPs等其它物质的浓度降低,RCA产物的相对含量也不断提高,但引物过多时,反而由于多余的引物不能引发滚环扩增反应而游离在体系中,致使体系中RCA产物的相对含量降低。

    图 5 引物对RCA产物的影响 Fig. 5 Effect of the primer concentration on RCA product. (a) An agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of primer; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of primer; (c) Comparison of analytical data for 260/280 and 260/230 at different concentrations of primer.

    4 结论

    滚环扩增反应是一种非常强大的等温核酸扩增技术,不管在生物学应用方面还是自组装方面都有着非常广泛的应用,合理地控制RCA产物的长度,可有助于我们估算出RCA产物重复单元的数量,通过化学计量的手段较为精确的计算出需要添加的互补链的数量,以提高组装的效率。本文通过以上几个考察因素的实验,发现在反应的前半个小时,时间对RCA产物的长度影响显著,半小时之后随着时间的增加变化不再明显。dNTPs的浓度对RCA产物的长度影响较大,增加dNTPs的浓度,RCA产物的长度会不断增长,至环状模板:dNTPs的摩尔浓度比为1 : 250时,RCA产物的长度则不再发生改变。酶和引物浓度对RCA产物的长度没有明显的影响,而时间、dNTPs浓度、引物浓度和酶浓度对RCA产物的浓度和含量都有一定的影响,特别是dNTPs的浓度越高RCA产物的浓度和含量越高。因此,可以通过控制反应的时间和dNTPs的浓度获得所需长度的RCA产物,通过合理调控酶和引物的浓度控制产物的浓度和含量,进行组装体的搭建和功能性的材料的制备,这既有利于后续反应的进行又降低了费用。

    参考文献
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