Acta Physico-Chimica Sinica  2017, Vol. 33 Issue (12): 2446-2453   (1881 KB)    
Raman Spectroscopic Analysis of Chondrocyte Dedifferentiation during in vitro Proliferation
JIN Lu-Di1, XU Jing-Jing2, ZHANG Yong3, YU Yue-Zhou2, LIU Chang3, ZHAO Dong-Ping3, YE An-Pei1,3,**    
1 Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, Beijing 100871, P. R. China;
2 Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing 100871, P. R. China;
3 Key Laboratory for the Physics & Chemistry of Nano-devices, School of Electronics Engineering & Computer Science, Peking University, Beijing 100871, P. R. China
Abstract: Seeded chondrocytes play a crucial role in current cartilage tissue engineering, yet both the quality and quantity of these cells could be impaired owing to cell dedifferentiation during in vitro proliferation. Here, we used micro-Raman spectroscopy to investigate changes in cellular components upon monolayer culturing of primary rat chondrocytes through multiple passages. Based on the average spectral profiles, we detected a series of Raman peaks and recognized related radicals such as nucleobases, pyranose rings, sulfate, tyrosine, proline, and amides at the single-chondrocyte level. Quantitative analysis of the Raman peak intensities showed that nucleic acids (at 789, 1094, 1576 cm-1) decreased significantly from passage 1 (P1) to passage 4 (P4), whereas lipids (at 1304 cm-1) and phosphate (at 957 cm-1) increased significantly. Moreover, the syntheses of two major hyaline cartilage-associated proteins, aggrecan and type-2 collagen, were impeded, as indicated by the marked decline in the levels of their specific components (glycosaminoglycan at 1042, 1063, 1126, 1160 cm-1, and hydroxyproline at 1207 cm-1). Taken together, these features reveal the diminished propagation and secretion abilities of passaged chondrocytes needed for matrix-induced implantation, and shed light on the molecular mechanism of chondrocyte dedifferentiation.
Key words: Chondrocyte     Dedifferentiation     Single-cell analysis     Micro-Raman spectroscopy     Molecular mechanism    

1 引言

软骨是哺乳动物重要的结缔组织,由软骨细胞(chondrocyte)和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成。人体中的关节透明软骨有承受负荷、减少关节间骨骼摩擦等重要功能,也因此而易消耗磨损,更有退行性病变所引发的关节炎、髌骨软化症等高发软骨病症。由于软骨组织中一般不存在血管和神经网络,细胞增殖能力较为有限1,受损后很难自行痊愈,且传统治疗方法鲜有持久的良好效果。组织工程为解决软骨疾病问题创造了新的可能,即用“基质诱导下的软骨细胞移植(matrix-induced chondrocyte implantation,MCI)”技术,将自体或异体(如鼠、兔等动物)软骨细胞植入具有诱导生长作用的三维支架中,再将支架整体移植到患者的受损关节软骨处,使其中的细胞不断生长、分裂并持续产生胶原蛋白等ECM成分,修补病变部位以实现软骨病症的治愈2-5

种子细胞作为组织工程三大要素之一,在很大程度上决定了软骨移植的修复效果。实验室条件下单层传代的传统细胞培养模式实现容易、操作简单,但研究发现随着培养代数和时间的增加,软骨种子细胞会逐渐丧失其正常细胞表型6-9,与体内关节透明软骨的原有细胞产生较大差异。这种现象被定义为“去分化(dedifferentiation)”,很可能引起所植入软骨组织的整体纤维化10,甚至诱发关节炎11,严重影响MCI技术的临床效果。软骨细胞体外增殖去分化的具体表现为:(1) 细胞增殖速度逐渐下降,生长曲线渐趋饱和,在若干次传代后完全停止增殖;(2) 通过显微镜或电镜观察,发现细胞形态由圆形、多角形渐变为类似成纤维细胞的长梭形12;(3) 通过组织学染色等方法,发现去分化软骨组织ECM中的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖含量降低13,而它们是由组织中的软骨细胞分泌产生;(4) 软骨细胞自身力学特性发生较大改变,与MCI三维支架材料的结合力也下降14。目前学界对软骨细胞去分化现象的单细胞研究成果较为有限,对其内部分子机制也尚不清楚。

拉曼光谱技术的原理基于样品分子振动所引起对入射光的非弹性散射,不同物质分子因散射光的不同频率移动而在光谱上有特异性的位置分布,光谱峰值强度则代表该物质相对含量。拉曼光谱是表征样品化学成分和分子结构信息的有力工具,业已成为化学、物理学、生物学、医学等交叉学科领域卓有成效的研究手段15, 16。显微拉曼光谱技术的信噪比与空间分辨率较高,相比其他单细胞分析技术具有无标记、无损伤的优点,可以实时监测细胞内生化物质分布及动态变化过程17, 18。目前,单细胞显微拉曼光谱已应用于细胞癌变临床诊断19、细胞个体老化检测20、人体血细胞早期病变筛查21等方向。在软骨医学方面,Kunstar等22通过拉曼光谱检测了不同层次软骨组织的成分差异;Kumar等23则探究了不同程度的关节炎组织中软骨细胞的拉曼光谱差异。

有鉴于此,我们测定了体外单层培养第1-4代软骨细胞的显微拉曼光谱,通过数据处理与文献比对,表征了单个软骨细胞内多种特征分子结构,定量分析细胞传代培养过程中关键成分的变化趋势,进而从分子生化效应的角度诠释软骨细胞体外增殖中的去分化现象。本工作为进一步研究软骨细胞去分化奠定了分析基础,也对组织工程学的机制探索与技术检验有一定指导意义。

2 实验部分
2.1 显微拉曼实验平台构建

相关实验在我们自建的共聚焦显微拉曼实验平台(详细结构如图 1所示)上进行。由固体激光器(Excelsior-532-200-CDRH,美国Spectra-Physics公司)发出的532 nm波长单模激光经外光路扩束、准直后导入显微镜(Axiovert 200,德国Zeiss公司),最终通过高数值孔径物镜(100×油镜,数值孔径N.A.= 1.3) 聚焦于样品。实验中控制样品处激光功率为10 mW的较低值,以免对细胞造成热损伤。

图 1 本工作所用的共聚焦显微拉曼实验平台 Fig. 1 Configuration of the experimental confocal Raman spectrometry platform Color online

样品所激发出的拉曼散射光通过二向色镜后再经过一个陷波滤波器(532 nm,美国ThorLab公司)以滤去瑞利散射成分,最终到达光谱仪(SpectraPro 2300i,美国Acton Corporation)。设置该光谱仪工作模式使其连续探测400-1700 cm-1范围的生物样品“指纹区域”,并通过液氮冷却CCD (Spect-400RB,美国Princeton Instruments公司)在-120 ℃工作温度下进行拉曼光谱采集,以尽量排除噪声干扰。

2.2 软骨细胞提取与培养

大鼠软骨细胞样品由北京大学医学部基础医学院朱敬先老师、李晨曦博士等馈赠,采集过程符合实验动物应用和保护指南。取一只6月龄健康大鼠放血处死,随即在无菌条件下解剖分离双侧膝关节面软骨,其间注意细致剥离其表面的关节滑膜等纤维组织。切下的软骨组织立即用含有“双抗”(含青霉素、链霉素各100 μg·mL-1,美国Hyclone公司)的足量PBS缓冲液(迈晨科技)连续冲洗3次,再在培养基环境下快速切成约1 mm3大小的碎片,放置在15 mL无菌离心管中,加浓度为0.2%的Ⅱ型胶原蛋白酶(美国Sigma公司),37 ℃下静置消化过夜。次日加血清终止消化,用细胞筛过滤消化物,将滤液以1000 r·min-1速度离心10 min并弃上清液。对沉淀中细胞用PBS缓冲液继续冲洗、离心3次后,将密度调整为1.5 × 105个/mL,接种在T25培养瓶中开始原代培养。

对软骨细胞采用传统的单层培养方式,在37 ℃、5% CO2培养箱环境下进行,所用培养基体积分数配比为:89%的DME/F12基础培养基(美国Hyclone公司,含2.5 mmol·L-1谷氨酰胺)、10%的澳洲胎牛血清(美国Gibco公司)、1%的双抗(美国Hyclone公司),每3天定时更换1次培养基。每6天(144 h)观察到细胞增殖至覆盖瓶底面积的80%以上(预示将发生接触抑制),此时用胰蛋白酶(浓度为0.25%,迈晨科技)消化细胞后均分为4份,其中3份用于继续传代培养,1份用于光谱实验。

在传代过程中我们发现,该大鼠软骨细胞在第5代时虽经长时间培养和多次更换培养基,其贴壁密度仍无明显增加迹象,即基本失去增殖能力而无法进行下一次传代。同时,在显微镜下也观察到贴壁状态下的软骨细胞从第1代的圆形、椭圆形逐渐变形,到第4代已呈现长梭状的类纤维化形态,证明软骨细胞去分化实际发生于第1–4代的传代培养过程中。因此,我们选取所培养的前4代软骨细胞作为拉曼光谱分析对象。

2.3 拉曼光谱采集与分析

将上述准备好的实验细胞样品用PBS缓冲液以1000 r·min-1、3 min冲洗离心3次,最后加10倍体积PBS缓冲液稀释后得到待测细胞悬浮样。取该悬浮样100 μL加入自制的石英玻片样品池中,在显微镜下随机寻找50个形状圆润、边缘明显、直径范围为12-16 μm的存活细胞个体作为该组样本,以减小样本误差干扰。为了避免细胞内不同结构成分差异带来误差,每次实验对准细胞核中心位置采集光谱30 s,每个细胞仅采集一次。为扣除背景影响,每组实验均在细胞同一焦面上对临近区域的PBS缓冲液采集一组背景拉曼光谱。另外,鉴于相邻两组拉曼光谱的采集间隔长达6天,故在每次正式采集光谱之前均用直径为5 μm的聚苯乙烯微球(美国Bangs Laboratories)进行标定,以确保光谱仪工作状态始终保持一致。

将所检测的第1-4代细胞依次记为P1-P4组,每组包含同一代细胞的50个拉曼光谱数据,即4组总数据量为200。在Matlab (美国MathWorks公司)软件编程环境下,每个光谱数据依次经过去除宇宙射线、扣除背景光谱、9点平滑滤波的同一套处理流程,并以1001 cm-1峰值为参照标准进行归一化,这也是为了进一步排除不同实验时间的系统状态偏差。

图 2所示,归一化后的P1-P4组拉曼光谱在400-1700 cm-1范围内的多个波数区间都存在明显的组间差异,但图中代表各组光谱标准误的灰色阴影部分宽度有限,这说明细胞光谱数据的组内差异相对较小。因此为方便起见,我们直接选用每组软骨细胞的均值拉曼光谱,在后续统计比较中采用单因素方差分析法(One-way ANOVA),通常当假设检验成立概率p < 0.05时可认为相关光谱强度差异具有统计显著性。

图 2 P1-P4组细胞归一化后的均值拉曼光谱 Fig. 2 Normalized Raman spectra of P1-P4 cells The colored (P1 = orange, P2 = violet, P3 = brown, P4 = green) solid lines indicate the average spectra normalized according to the peak intensities at 1001 cm-1. The grey-shaded areas represent the standard errors. The Raman excitation wavelength is 532 nm. Color online

3 结果与讨论
3.1 软骨细胞组分的拉曼光谱归属

图 3所示,用MATLAB软件可自动识别出P1-P4组软骨细胞均值拉曼光谱的多个共有振动特征峰如789、861、935、1001、1121、1163、1245、1442、1572、1652 cm-1等(考虑到峰移影响,在此取P1组均值拉曼光谱的峰位波数值),分别代表细胞中含量较为丰富的多种分子振动模式。除此之外,4组拉曼光谱中还各有一些较弱特征峰存在。比照前人文献对软骨细胞及组织内主要成分的拉曼谱峰归属24-35,筛选其中可明确解析、具有代表性的17个特征峰集合,列出其在P1-P4组光谱上的波数位置如表 1所示。这些峰分别指示软骨细胞中碱基、氨基酸、酰胺键、糖基、脂质链等分子结构,考虑到不同实验条件下拉曼光谱可能存在微小的波数差异,测得峰位与文献数据的符合程度较好。

图 3 P1-P4组软骨细胞均值拉曼光谱的共有特征峰 Fig. 3 Common peak selections from the average Raman spectra of P1-P4 chondrocytes The colored (P1 = orange, P2 = violet, P3 = brown, P4 = green) solid lines indicate the normalized spectra, which are vertically offset for clarity. The Raman excitation wavelength is 532 nm. Color online

表 1 P1-P4组软骨细胞拉曼光谱特征峰位置及其归属24-35 Table 1 Raman peak wavenumbers of P1-P4 chondrocytes and respective vibrational assignments24-35

4组软骨细胞均值拉曼光谱间的差异性显示出相应生化成分在细胞传代过程中的变化,这有助于软骨细胞去分化分子机制的初步鉴识:一方面,多数共有特征峰从P1组到P4组发生峰位移动,如861 cm-1特征峰的总体红移与935、1121 cm-1特征峰的总体蓝移都源于蛋白质分子空间构象的改变34;另一方面,我们也观察到部分特征峰在P1-P4组有明显的强度差异,如代表胡萝卜素的1515 cm-1特征峰仅在P3组出现,这在一定程度上反映出软骨细胞内分子含量的动态变化。

3.2 软骨细胞去分化的分子变化分析

根据前述软骨细胞去分化过程的具体表现,其生化考察应至少关注三个方面,即:细胞增殖活力(遗传物质复制速率)、细胞分泌活性(特别是对ECM中主要组分的分泌效率36)、细胞表型变异(反映自身化学成分变化)。为了在分子生化水平上解析这些现象,我们对P1-P4组均值拉曼光谱的多个特征峰强度进行代际对比(见图 4,此处忽略各组光谱峰位移动影响),希望以此揭示软骨细胞内各类物质的相对含量变化。

图 4 P1–P4组软骨细胞若干拉曼特征峰的相对强度比较 Fig. 4 Comparisons of relative Raman peak intensities from P1–P4 chondrocytes (p < 0.05) Dependences of the peak intensities are shown as functions of chondrocyte passage number (1-4): (a) 787, 1094, 1576 cm-1; (b) 1042, 1063, 1126, 1160 cm-1; (c) 1207 cm-1; (d) 1246 cm-1 to 1270 cm-1; (e) 1304 cm-1; (f) 957 cm-1.Data represent the normalized mean intensities of Raman peaks, and bars represent the standard errors. Color online

3.2.1 核酸(DNA/RNA)分子含量变化

作为遗传信息载体,DNA和RNA的含量既表示细胞分裂增殖活力,也直观反映细胞分泌表达能力。DNA和RNA分子结构高度近似,故分析时将两者合并为“核酸(DNA/RNA)”一类。

根据文献35,787、1094、1576 cm-1为核酸分子的3个特征峰,分别代表DNA/RNA中磷酸二酯键、各种碱基等分子结构的振动模式。如图 4(a)所示,可以发现随着细胞传代次数的增加,各峰值强度均呈明显下降的总体趋势,说明在去分化过程中软骨细胞的增殖、生长、分化特性有弱化倾向。注意到P2组1094 cm-1峰值强度相比P1组略有增加,我们认为软骨细胞在体外培养的最初阶段应先经历一个生长状态有所改善的适应期,之后才受到去分化的明显影响。

3.2.2 蛋白聚糖分子含量变化

软骨ECM中有诸多特异性大分子,包括蛋白聚糖,Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型胶原,基质蛋白,软骨连接蛋白等。其中,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖占比较大,两者相互结合成网状结构,使软骨具有一定弹性,对维持软骨形状、承载外来负荷起到重要作用,也是评价软骨细胞分泌功能的主要标准13

透明软骨组织内的蛋白聚糖由一个核心蛋白与一条或多条侧链糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)等以共价键连接构成,并通过连接蛋白与透明质酸分子相结合37。蛋白聚糖中常见的GAG分子类型有硫酸角质素、硫酸软骨素等。

参照表 1及其他文献38, 39,我们选取1042、1063、1126、1160 cm-1为软骨细胞中GAG分子结构的4个特征峰,如图 4(b)所示。其中,1063 cm-1峰可表征硫酸基团31,与硫酸软骨素与硫酸角质素有关,可视为GAG的强特异性峰。我们发现,这4个特征峰的强度虽在P1-P2阶段有所增加(亦可视为细胞经历初始适应期的状态表现),但在之后的P2-P4阶段又呈现出明显下降的总趋势,说明软骨细胞中GAG的合成水平有所减弱,这与受到去分化影响的羊肋软骨组织GAG染色结果40一致。GAG合成下降可能与蛋白激酶C(PKC)基因表达受到抑制的原理41有关,这有待于合成生物学的进一步探究。

3.2.3 Ⅱ型胶原分子含量变化

在关节透明软骨的胶原总量中,Ⅱ型胶原占比达80%以上,为软骨提供了特有的张力和硬度,是软骨细胞高度分化、软骨组织趋于成熟的标志。Ⅱ型胶原中富含羟脯氨酸,且羟脯氨酸上的羟基几乎全部与糖类结合,因而糖化率较高。与之相反的是Ⅰ型胶原,不含羟脯氨酸组分而含糖量低,作为动物组织纤维形成胶原在人体内有更为广泛的分布,特别是在成熟骨质中起到关键作用42

我们在此仅选取1207 cm-1特征峰,如图 4(c)所示,观察到该特征峰的强度随软骨细胞传代次数递增而有所下降。1207 cm-1峰特异性表征苯环的伸缩振动,其峰值下降源于软骨细胞中羟脯氨酸(通常含苯环结构)的减少43。这一现象说明软骨细胞在去分化时对Ⅱ型胶原的分泌减弱,对应去分化软骨细胞表型纤维化过程中Ⅱ型胶原向Ⅰ型胶原的转化44

另外,我们还发现图 4(d)中随着软骨细胞代数的增加,1246与1270 cm-1两个特征峰的强度比值I(1246)/I(1270) 明显上升。已知1245-1279 cm-1区域被称为蛋白质拉曼光谱的酰胺Ⅲ带(amide Ⅲ),其中1246 cm-1峰与1270 cm-1峰各自代表蛋白质二级结构中的无规卷曲和有序卷曲45, 46。这两个特征峰的强度比上升,表明去分化会导致软骨细胞内胶原蛋白结构的无规卷曲减少、有序卷曲增加,即对软骨细胞的Ⅱ型胶原网络造成一定破坏47

3.2.4 脂质分子含量变化

1304 cm-1峰通常被认为是细胞中脂质分子的CH2/CH3振动特征峰48。由图 4(e)可以看到,该峰强度随软骨细胞增殖代数增加呈上升趋势,故可认为脂质在去分化软骨细胞中含量增加。但鉴于迄今尚无软骨细胞去分化与脂质分子关系的相关报道,故该结果还需要其他方面研究的支持。

3.2.5 磷酸盐含量变化

生物体内主要的矿化无机盐成分为磷酸盐(特征峰在957 cm-1,代表物质为羟基磷灰石,主要分布于骨纤维组织中)。图 4(f)中957 cm-1峰强度49随细胞传代有上升趋势,说明软骨细胞内磷酸盐成分的确有所增加。

4 结论

我们基于单细胞显微拉曼光谱技术,检测了体外单层培养第1-4代大鼠软骨细胞的化学组成。通过对拉曼光谱主要特征峰强度的比较分析,得到软骨细胞体外增殖去分化过程中若干重要组分的变化趋势:核酸含量减少,蛋白聚糖与Ⅱ型胶原分泌水平下降,脂质与磷酸盐含量增加等。去分化会导致体外培养软骨细胞表型改变、功能失调,不利于组织工程的应用。本研究结果有助于在分子水平上揭示软骨细胞传代培养中的去分化机制,从而对MCI技术优选种子细胞、克服去分化影响提供指导。

此外,调整细胞密度、添加调控因子50、改变培养环境51等措施都能有效提升传统单层细胞培养方法的效率,更有三维支架、离心管、生物反应器等诸多改进型培养方法52。在本工作基础上,结合拉曼光谱技术,可以对所培养的软骨种子细胞分别进行质量鉴定,并直观对比这些培养方法对细胞去分化的实际抑制效果。

本研究结果也表明,在细胞分子机制的定量研究方面,无标记、无损伤的单细胞拉曼光谱技术确有一定优势,有望应用于更广泛的组织工程学课题研究。

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